SweMagrose IDA-Co magnetne agarozne kroglice za čiščenje beljakovin His-Tag

 

Ime izdelka	mačka št.	spec.
SweMagrose IDA-Co magnetne agarozne kroglice za čiščenje beljakovin His-Tag	G3655-1ML	1 ml
	G3655-5ML	5 ml

 

 

Ta izdelek je pripravljen iz agaroznih magnetnih kroglic, modificiranih z IDA, in keliranja nikljevih ionov. Lahko učinkovito in hitro očisti s histidinom označene beljakovine v bioloških vzorcih brez centrifugalne filtracije. Postopek je preprost in primeren za čiščenje topnih histidinskih označevalnih proteinov, izraženih v supernatantu ali celicah bakterij, kvasovk in celic. Lahko se kombinira tudi z visoko zmogljivo opremo za čiščenje beljakovin za presejanje in ločevanje beljakovin.

Co2+ ima 4 ligande in manj nespecifične adsorpcije, Ni2+ ima 6 ligandov in močno sposobnost vezave na beljakovine, za več ciljnih beljakovin lahko izberete naše druge magnetne agarozne kroglice SweMagrose IDA-Ni za His -Tag Protein Purification (G3654).

 

 

Ladja z mokrim ledom; Hraniti pri 4 stopinjah, velja 12 mesecev.

 

 

Številka komponente	Komponenta	G3655-1ML	G3655-5ML
G3655	SweMagrose IDA-Co magnetne agarozne kroglice za čiščenje beljakovin His-Tag	1 ml	5 ml
Priročnik		1 kos

 

 

1. Konfiguracijo različnih reagentov lahko navedemo na naslednji način. Uporabniki lahko izberejo ustrezno količino magnetnih kroglic in formulo pufra glede na situacijo reagentov.

Komponenta	Glasnost
10 × PBS (200 mM natrijev fosfat, pH 7,4)	50 ml
10x imidazolni pufer (200 mM natrijevega fosfata, 5 M imidazola, pH 7,4)	50 ml
Odstranjevalec kobalta (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 mM EDTA, pH 7,4)	10 ml
Alkalna raztopina za pranje (0.5 M NaOH, 2 M NaCl)	10 ml
href="javascript:;" Kobaltov sulfat (100 mM CoSO4)	15 ml
Raztopina za konzerviranje (20% etanol)	50 ml

 

2. Konfiguracija medpomnilnika

Učinkovitost vezave ciljnega proteina s kroglicami za kelatiranje kovinskih ionov bo neposredno vplivala na učinkovitost čiščenja ciljnega proteina, različni pufri pa bodo do neke mere vplivali tudi na obnovitev in čistost ciljnega proteina. Zato morajo uporabniki pred obsežnim čiščenjem beljakovin oblikovati lastne poskuse za pregledovanje pufrov, primernih za ciljne beljakovine, vključno z vezavnim pufrom, pralnim pufrom in elucijskim pufrom. Puferski sistem, ki je naveden spodaj, je primeren za čiščenje večine proteinov s histidinskimi oznakami za referenco uporabnikov:

Vezivni pufer: 20 mM natrijevega fosfata, 500 mM NaCl, 5~50 mM imidazola, pH 7,4

Pralni pufer: 20 mM natrijev fosfat, 500 mM NaCl, 50~100 mM imidazol, pH 7,4

Elucijski pufer: 20 mM natrijev fosfat, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 7,4

3. Obdelava vzorca

a) E. coli, kvasovke in drugi znotrajcelično izraženi proteini: dodajte 5~10 mL vezavnega pufra na gram celic, dodajte inhibitor proteaze (npr. PMSF v končni koncentraciji 1 mM), ponovno suspendirajte celice in ultrazvočno lizirajte celice v ledeni kopeli, tj. vzorec surovih beljakovin. Če je vzorec preveč viskozen, lahko surovemu vzorcu po potrebi dodamo ustrezno količino nukleaze in ga postavimo na led za 30 minut, da razgradimo nukleinske kisline. Alternativno lahko po potrebi izvedete centrifugiranje vzorca beljakovin.

b) Ekstracelularno izražen protein: Vzorec surove beljakovine smo dobili, ko smo supernatant zunajcelične ekspresije razredčili z enako količino vezavnega pufra.

c) Znotrajcelično izražene beljakovine v živalskih celicah: vzemite ustrezno količino živalskih celic, enkrat sperite z ustrezno količino PBS (pridobljenega sami), zavrzite supernatant, resuspendirajte z ustrezno količino vezavnega pufra, ki vsebuje 1 % (v/v) Triton X -100 ali 1 % (v/v) NP-40, dodajte inhibitor proteaze (npr. PMSF v končni koncentraciji 1 mM), in ga postavite na led za 10 minut, to je vzorec surovih beljakovin.

4. Vezava tarčnega proteina na magnetne kroglice:

a) Suspendirajte 2 g mokre mase organizmov z 10 ml vezavnega pufra in po fragmentaciji in lizi dodajte vzorec ciljne surove beljakovine v epruveto za centrifugo, ki vsebuje predhodno obdelane magnetne kroglice, in epruveto postavite v vrtinčni mešalnik in stresajte 15 s. Ciljni vzorec surovih beljakovin se nato doda v epruveto za centrifugo s predhodno obdelanimi magnetnimi kroglicami.

b) Epruveto za centrifugo postavite na rotacijski mešalnik za 20-30 min pri sobni temperaturi (če je potrebno, jo lahko vrtite in mešajte 1 uro pri nizki temperaturi 2-8 stopinj, da preprečite razgradnjo ciljnega proteina) .

c) Postavite epruveto za centrifugo na magnetni separator za ločevanje, prenesite supernatant v novo epruveto za centrifugo za nadaljnje testiranje in odstranite epruveto za centrifugo iz magnetnega separatorja za nadaljnje korake pranja.

5. Pranje magnetnih kroglic:

a) Dodajte 10 mL pufra za izpiranje v epruveto za centrifugo, ki vsebuje magnetne kroglice, epruveto večkrat nežno obrnite, da ponovno suspendirate kroglice, jih magnetno ločite in raztopino za izpiranje prenesite v novo epruveto za centrifugo za vzorčenje. Ta postopek enkrat ponovite.

b) Dodajte 10 ml pralnega pufra v epruveto za centrifugo, ki vsebuje magnetne kroglice, da resuspendirate kroglice, prenesite suspenzijo kroglic v novo epruveto za centrifugo (da preprečite kontaminacijo ciljnih proteinov z nespecifično adsorbiranimi proteini na steni prvotne epruvete za centrifugo ), magnetno ločite in s pipeto odnesite supernatant v epruveto za zbiranje pralnega pufra.

6. Ciljna elucija beljakovin

a) Uporabniki lahko prilagodijo koncentracijo ciljnega proteina tako, da po potrebi spremenijo volumen elucije. Dodajte 2-10 ml elucijskega pufra, večkrat nežno obrnite epruveto, da suspendirate kroglice, magnetno ločite kroglice in zberite eluat v novo centrifugirno epruveto, ki je vzorec prečiščenega ciljnega proteina.

a) Po potrebi enkrat ponovite zgornje korake, da vzorec zberete v novo centrifugalno epruveto, da preverite, ali je ciljni protein popolnoma eluiran.

b) Zaznajte ciljni protein s SDS-PAGE ali Western blot. Če morate izmeriti koncentracijo beljakovin, lahko uporabite elucijski pufer za ničelno koncentracijo ali uporabite dializo ali ultrafiltracijo za odstranitev imidazola in nato izmerite koncentracijo.

7. Naknadna obdelava magnetnih kroglic

a) Dodajte 5 mL elucijskega pufra v epruveto za centrifugo, ki vsebuje magnetne kroglice, večkrat obrnite epruveto gor in dol, da suspendirate kroglice, jih magnetno ločite in odstranite supernatant.

b) Dvakrat ponovite zgornje korake.

c) Dodajte 5 mL ddH O v centrifugirno epruveto, ki vsebuje magnetne kroglice, večkrat obrnite epruveto gor in dol, da suspendirate kroglice, jih magnetno ločite in odstranite supernatant.

d) Dvakrat ponovite zgornje korake.

e) Magnetnim kroglicam dodajte raztopino za konzerviranje, da dobite skupno prostornino 5 ml, shranite pri 2-30 stopinjah (za dolgotrajno shranjevanje postavite pri 2-8 stopinjah) in jih lahko uporabite za naslednje čiščenje istega proteina.

8. Regeneracija magnetnih kroglic

Ko se magnetne kroglice neprekinjeno uporabljajo 3-krat ali večkrat, se lahko sposobnost vezave tarčnih proteinov znatno zmanjša, zato je priporočljivo izvesti postopek regeneracije magnetnih kroglic. Vzemite 5 ml 10 % (v/v) suspenzije magnetnih kroglic kot primer za podrobno ilustracijo postopka regeneracije magnetnih kroglic.

a) Suspenzijo magnetnih kroglic smo magnetno ločili, odstranimo supernatant in odstranimo epruveto za centrifugo iz magnetnega separatorja, dodamo 5 mL ddH2O v epruveto za centrifugo in večkrat obrnemo epruveto za centrifugo gor in dol, da ponovno suspendiramo magnetne kroglice. , magnetno ločite in odstranite supernatant.

b) Dodajte 5 mL odstranjevalca kobalta, centrifugirno epruveto večkrat obrnite gor in dol, da ponovno suspendirate magnetne kroglice, zavrtite in mešajte 5 minut pri sobni temperaturi, magnetno ločite in odstranite supernatant. Enkrat ponovite ta korak.

c) Dodajte 5 mL ddH2O v centrifugirno epruveto, ki vsebuje magnetne kroglice, večkrat obrnite epruveto gor in dol, da suspendirate kroglice, jih magnetno ločite in odstranite supernatant.

d) Alkalna obdelava (izbirni korak): dodajte 5 mL alkalnega pufra za izpiranje, centrifugirno epruveto večkrat obrnite gor in dol, da ponovno suspendirate kroglice, zavrtite in mešajte 5 minut pri sobni temperaturi, magnetno ločite in odstranite supernatant. Dodajte 5 mL ddH2O, centrifugirno epruveto večkrat obrnite gor in dol, da resuspendirate kroglice, magnetno ločite in odstranite supernatant. Ponovite korak izpiranja z ddH2O 3-5-krat, dokler ni izpiralna raztopina nevtralna.

e) Dodajte 5 ml nikljevega klorida, centrifugirno epruveto večkrat obrnite gor in dol, da ponovno suspendirate kroglice, zavrtite in mešajte 20 minut pri sobni temperaturi, magnetno ločite in odstranite supernatant.

f) Dodajte 5 mL ddH2O in centrifugirno epruveto večkrat obrnite gor in dol, da ponovno suspendirate kroglice, magnetno ločite in odstranite supernatant. Ta korak ponovite 4-krat.

g) Magnetnim kroglicam dodajte raztopino za konzerviranje, da dobite skupno prostornino 5 ml, in shranite pri 2-30 stopinjah (za dolgotrajno shranjevanje postavite pri 2-8 stopinjah).

 

 

1. Ta izdelek je shranjen v 20 % etanolu in ga je treba pred uporabo zamenjati.

2. Kroglic ne zamrzujte ali sušite, saj lahko to vpliva na končno uporabo.

3. Uporabite z ustreznim magnetnim okvirjem.

 

Samo za raziskovalno uporabo. Ni za uporabo v diagnostičnih ali terapevtskih postopkih!

 

 

Priljubljena oznake: swemagrose ida-co magnetne agarozne kroglice za his-tag čiščenje beljakovin, Kitajska swemagrose ida-co magnetne agarozne kroglice za his-tag čiščenje beljakovin proizvajalci, dobavitelji, tovarna