Kalcein AM

 

Ime izdelka	mačkašt.	spec..
Kalcein AM	G1728-0.1ML	0.1 ml

 

 

Calcein AM (Calcein acetoxymethyl ester), temelji na Calceinu z uvedbo acetoxymethyl ester (AM) skupine, ki poveča hidrofobnost, zato zlahka prodre v membrano živih celic. Sam Calcein AM je za celico prepustna, nefluorescenčna in hidrofobna spojina, ki jo ob vstopu v celico hidrolizirajo endogene esteraze v celici, da proizvede močno negativno nabito polarno molekulo Calcein, ki ne more predreti celične membrane in je tako ostane v celici, medtem ko kalcein (največja valovna dolžina vzbujanja: 494 nm; največja emisijska valovna dolžina: 517 nm) lahko oddaja močno zeleno fluorescenco. V primerjavi z drugimi podobnimi sondami (npr. BCECF AM in CFDA AM) je Calcein AM trenutno ena najbolj idealnih fluorescenčnih sond za barvanje živih celic zaradi zelo nizke citotoksičnosti, praktično brez vpliva na celične funkcije, kot je celična proliferacija ali kemotaksa limfocitov, in nizka pH občutljivost.

Zaradi pomanjkanja esteraze v mrtvih celicah se Calcein AM uporablja samo za testiranje viabilnosti in kratkotrajno označevanje živih celic. Rdeče fluorescentno barvilo nukleinske kisline propidium jodid (PI) ne prodre skozi celično membrano živih celic, gre skozi neurejeno področje membrane odmrle celice do jedra in se vgradi v dvojno vijačnico DNA celice, da proizvede rdečo fluorescenco ( vzbujanje: 535 nm, emisija: 617 nm), zato PI obarva samo odmrle celice. Calcein AM se pogosto uporablja v kombinaciji s propidijevim jodidom (PI) za sočasno dvojno fluorescenčno barvanje živih in mrtvih celic. Ker je tako kalcein kot PI-DNA mogoče vzbuditi pri 490 nm, lahko žive in odmrle celice opazujemo hkrati s fluorescenčno mikroskopijo. Pri 545 nm vzbujanju je mogoče opazovati samo odmrle celice.

Calcein AM se lahko uporablja v večini celic sesalcev. Dokazano je bilo, da se Calcein AM lahko uporablja v nekaterih rastlinskih celicah, kot so celice, podobne robu korenin Arabidopsis, in nekatere kvasovke, kot sta Pichia anomala in Saccharomyces cerevisiae. Nekateri paraziti, kot je Leishmania, ne morejo vstopiti v žive celice zaradi komponent celične membrane, vendar lahko Calcein AM vstopi v celice parazitov v zgodnjih fazah apoptoze, zato se uporablja skupaj s PI za odkrivanje parazitov v zgodnjih fazah apoptoze. Calcein AM ni primeren za uporabo na glivicah in bakterijah, ker imajo celične stene, ki Calceinu AM preprečujejo vstop v celice.

Sam kalcein je indikator kompleksiranja kovin in fluorescentni signal se ugasne, ko kompleksira s kovinskimi ioni, kot je Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Fe³⁺, in Mn²⁺pri fiziološkem pH, zaradi česar je Calcein AM tudi zelena fluorescentna sonda, ki jo je mogoče uporabiti za določanje prehodne pore mitohondrijske prepustnosti.

Ta izdelek, Calcein AM, je visoke čistosti in je raztopljen v brezvodnem DMSO pri koncentraciji 2 mM. Običajno uporabljena končna koncentracija Calceina AM je 0.1-5.0 μM. Za bolj zaželen rezultat prilagodite končno koncentracijo Calceina glede na vrsto celic in dejansko situacijo poskusa.

 

 

-20 stopnja za skladiščenje in transport, velja 12 mesecev.

 

 

Komponenta	G{0}.1ML
Kalcein AM	0.1 ml
Priročnik	1 kos

 

 

Pripravljena je bila delovna raztopina za barvanje s kalceinom AM:

Produkt razredčite s primernim pufrom, kot je gojišče brez seruma, HBSS (G4203) ali PBS (G4202), da pripravite delovno raztopino za barvanje s kalceinom AM pri koncentraciji od 0.1-5.0 µM.

Opomba: Priporočljivo je, da se končna koncentracija Calceina AM ustrezno prilagodi glede na tip celice in eksperimentalno realnost.

 

Postopki

1. Fluorescenčni mikroskopski test ali fluorescenčni zimografski test za suspenzijske celice:

a) Celice so bile preštete po določenih zdravljenjih v skladu z načrtom eksperimenta. Vzemite ustrezne celice in jih centrifugirajte pri 250 × g 5 minut pri sobni temperaturi, zavrzite supernatant in dodajte ustrezen volumen delovne raztopine za barvanje Calcein AM, da bo gostota celic približno 1 × 10⁶/ml.

b) Celice inkubirajte pri 37 °C 30-45 min, optimalni čas inkubacije je različen za različne celice. Upoštevajte 30 minut kot začetni čas inkubacije in ga optimizirajte glede na specifično eksperimentalno situacijo, da dobite bolj idealne rezultate odkrivanja.

c) Na koncu inkubacije centrifugirajte pri 250 × g 5 minut, aspirirajte supernatant in počasi resuspendirajte celice z dodajanjem 37 °C predhodno segretega gojišča.

d) Ponovite korak c dvakrat ali večkrat, da ustrezno operete in odstranite ostanke raztopine za madeže.

e) Zamenjajte sveže 37 °C predhodno ogreto gojišče in inkubirajte pri 37 °C še 30 minut stran od svetlobe, da zagotovite, da znotrajcelične esteraze dovolj hidrolizirajo Calcein AM, da proizvedejo Calcein z zeleno fluorescenco.

f) Celice smo centrifugirali pri 250 × g 5 minut pri sobni temperaturi, večino gojišča smo aspirirali, celice pa resuspendirali s preostalim gojiščem in razmazali ter jih nato opazovali pod fluorescenčnim mikroskopom ali detektirali s fluorescenco. zimografija. Največja valovna dolžina vzbujanja kalceina je 494 nm, največja valovna dolžina emisije pa 514 nm. Po potrebi se lahko izvede drugo fluorescenčno ponovno obarvanje, celotnemu procesu pa se je treba izogniti z uporabo svetlobe.

 

2. Fluorescenčni mikroskopski test adherentnih celic ali test označevanja s fluorescenčnim encimom:

a) Celice so bile cepljene na petrijevke, plošče za celične kulture z več vdolbinicami ali pajke celice in obdelane na določene načine v skladu z načrtom eksperimenta.

b) Aspirirajte raztopino kulture in 1-2-krat sperite celice s PBS.

c) Dodajte ustrezno količino raztopine za barvanje Calcein AM in nežno pretresite, da barva enakomerno prekrije vse celice. Na splošno je prostornina 96-plošče z vdolbinicami 100 ul na vdolbinico, 24-plošča z vdolbinicami je 250 ul na vdolbinico, 12-plošča z vdolbinicami je 500 ul na vdolbinico in 6- plošča z vdolbinicami je 1 ml na vdolbinico.

d) Inkubirajte pri 37 °C 30-45 min, optimalni čas inkubacije se razlikuje za različne celice. Za začetni čas inkubacije vzemite 30 minut in optimizirajte čas inkubacije glede na uporabljene celice, da dosežete bolj idealen učinek obarvanja.

e) Na koncu inkubacije smo gojišče zamenjali s svežim, predhodno segretim gojiščem pri 37 °C in inkubirali pri 37 °C še 30 minut stran od svetlobe, da zagotovimo, da je znotrajcelična esteraza dovolj hidrolizirala Calcein AM, da je proizvedel Calcein z zeleno fluorescenco. .

f) Aspirirajte tekočino kulture, sperite s PBS 2-3-krat in nato dodajte tekočino celične kulture brez seruma, ki jo lahko opazujete pod fluorescenčnim mikroskopom ali zaznate s fluorescenčnim encimskim markerjem. Kalcein ima največjo valovno dolžino vzbujanja 494 nm in največjo emisijsko valovno dolžino 514 nm in se lahko dodatno obarvajo z drugimi fluorescencami, če po želji, pri čemer celoten postopek hranite stran od svetlobe.

 

3. Test s pretočno citometrijo:

a) Po razgradnji sprijetih celic s tripsinom ponovno suspendirajte celice v gojišču, suspendirajte celice za neposredno uporabo, preštejte, centrifugirajte ustrezno količino celic pri 250 × g 5 minut pri sobni temperaturi, zavrzite supernatant in dodajte ustrezno volumen delovne raztopine za barvanje Calcein AM, tako da so celice suspenzija ene celice in je gostota celic približno 1 × 106 /ml, z volumnom 1 ml za vsak vzorec. OPOMBA: Pripraviti je treba vzorec celic samo s pufrom za uporabo kot negativno kontrolo v testu s pretočno citometrijo. negativno kontrolo za test s pretočno citometrijo, zato je zaželeno, da ta pufer ostane enak pufru, uporabljenemu za pripravo delovne raztopine za barvanje Calcein AM.

b) Inkubirajte 30 minut pri 37 °C stran od svetlobe.

c) Po končani inkubaciji celice zberemo s centrifugiranjem pri 250 × g 5 minut pri sobni temperaturi. Dodajte 1 ml pufra na vzorec, nežno resuspendirajte in zberite celice s centrifugiranjem pri 250 × g 5 minut pri sobni temperaturi. Opomba: Ta korak odstrani odvečno barvilo in reagente, ki lahko povzročijo dušenje fluorescence.

d) Resuspendirajte celice s 400 µl pufra. Po potrebi se lahko izvede tudi nadaljnje barvanje. Upoštevajte, da je treba celoten postopek izvajati stran od svetlobe. Po obarvanju se vzorci postavijo na led in jih je mogoče pretočno citometrično zaznati in analizirati v 1 uri.

e) Upoštevajte, da so bili za nastavitev negativne kontrole pretočnega citometra uporabljeni samo puferski in neobarvani vzorci celic. Kalcein ima največjo valovno dolžino vzbujanja 494 nm in največjo valovno dolžino emisije 514 nm.

 

 

1. Vsa fluorescentna barvila imajo težave z dušenjem, zato je treba paziti, da se čim bolj izogibamo svetlobi, da upočasnimo dušenje fluorescence.

2. Calcein AM je zelo občutljiv na vlago in je nagnjen k razgradnji v vlažnem okolju, zato je treba raztopino Calcein AM po vsakem odvzemu dobro zapreti s pokrovčkom. Priporočljivo je shranjevanje v ločenih zaprtih embalažah v skladu z enkratnim odmerkom. Ne uporabljajte konic pipet, ki vsebujejo vodo.

3. Ker Calcein AM ni stabilen v vodnih raztopinah, kot je PBS, je treba delovno raztopino za barvanje pripraviti in uporabiti takoj.

4. Serum in fenol rdeče v gojišču vplivata na obarvanje s Calcein AM, zato je priporočljivo, da se celice pred dodajanjem delovne raztopine Calcein AM dobro sperejo.

5. Celice, označene s kalceinom AM, z enakomerno fluorescenco so dobra izbira za sledenje celic in splošno citoplazemsko barvanje, vendar se ne veže na nič in se lahko aktivno umakne iz celice v nekaj urah ter zadrževanje kalceina v živih celicah odvisno od inherentnih značilnosti tipa celice in pogojev gojenja.

6. Barvanju s kalceinom AM ne sme slediti fiksacija z aldehidom, sicer se bo kalcein med fiksacijo izgubil. Poleg tega bo vsaka motnja plazemske membrane (npr. sredstva za odstranjevanje vodnega kamna ali obdelava s tripsinom) povzročila uhajanje barvila iz celic.

7. Če ima Calcein AM težave pri vstopu v celice, lahko uporabite površinsko aktivno snov, kot je Pluronic F127. Namesto gojišča lahko uporabimo tudi raztopino Calceina AM v koncentraciji 1/10.

8. Ta izdelek je omejen na uporabo v znanstvenih raziskavah s strani strokovnjakov in se ne sme uporabljati za diagnostične postopke ali zdravljenje, hrano ali zdravila ali shranjevati v običajnih bivališčih.

9. Zaradi vaše varnosti in zdravja nosite laboratorijski plašč in rokavice za enkratno uporabo.

 

Samo za raziskovalno uporabo!

 

 

Priljubljena oznake: calcein am, Kitajska calcein am proizvajalci, dobavitelji, tovarna